鸡OC-116基因编码区真核表达载体的筛选及其Real-time PCR检测体系的优化

摘要：实验旨在比较鸡OC-116基因编码区在不同载体上的表达差异,筛选表达量相对较高的重组质粒,同时优化OC-116基因编码区的Real-timePCR体系;制备OC 116-GFP、OC 116-pcDNA、OC116（M1）-pcDNA和OC 116（M 1）-GFP4种质粒,分别转染CHO细胞,瞬时表达后制备cDNA、提取总蛋白;然后优化OC-116基因编码区的Real-timePCR体系,并分别通过Real-time PCR、Western blotting鉴定表达水平相对更高的重组质粒.结果表明：优化PCR产物中GC碱基的分布可以排除Real-time PCR反应中熔解曲线双峰问题;更换其他实验空间可以有效解决Real-time PCR反应中的疑似气溶胶污染;pcDNA3.1/myc-His（-）A表达载体诱导OC-116基因编码区翻译表达的能力比pEGFP-N1强;在两类真核表达质粒中,Kozak序列的引入均能明显增强OC-116基因编码区的转录以及翻译水平.结果提示,Real-time PCR反应中双峰熔解曲线以及气溶胶污染可以通过引物设计、更换实验环境进行解决;携带Kozak序列的OC-116（M1）-pcDNA重组质粒目标基因转录、翻译表达水平相对更高,可用于后续研究.