穿膜肽TAT的原核表达及其穿膜效果的初步研究

摘要：为进一步建立蛋白诱导水牛iPS细胞体系，本实验对穿膜＆TAT与标记蛋白EGFP进行融合表达．同时引入核定位NLS序列，获得纯化蛋白后进行细胞共培养试验，以探讨穿膜肽TAT对携带水牛干细胞转录因子纯化蛋白进入细胞内的效果。首先通过PCR扩增、TA克隆、双酶切以及‘r4连接等步骤构建原核表达载体pET—EGFP和pET—NLS—EGFP—TAT；再将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），经I胛G诱导，用SDS—PAGE电泳检测融合蛋白表达；然后用HisTrapHP层析柱纯化融合蛋白，经复性、透析和浓缩后，最后将纯化的EGFP蛋白和NLS—EGFP—TAT蛋白分别添加到水牛成纤维细胞中共培养。结果表明：成功表达了融合蛋白EGFP（47．3ku）和NLS—EGFP—TAT（50．1ku）；纯化蛋白与水牛成纤维细胞共培养5～8h后，EGFP蛋白不能进入细胞内．而NLS—EGFP—TAT蛋白在穿膜肽TAT的帮助下能够顺利进入细胞内，但未能显著定位到细胞核内。